嚙齒類動(dòng)物（如大鼠和小鼠）是研究行為機(jī)制的廣泛模式動(dòng)物。近年來(lái)，隨著成像技術(shù)持續(xù)迭代，科研人員得以借助新技術(shù)解析調(diào)控各類動(dòng)物行為的底層神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)，其中鈣成像技術(shù)應(yīng)用尤為突出。依托該技術(shù)，研究者可實(shí)時(shí)觀測(cè)神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)活動(dòng)模式，追蹤不同行為下神經(jīng)元響應(yīng)的動(dòng)態(tài)變化。本文將帶您全面了解這項(xiàng)技術(shù)，以及它如何助力動(dòng)物行為學(xué)相關(guān)研究。

一、什么是鈣成像？

鈣成像技術(shù)能夠?qū)崟r(shí)觀測(cè)、量化單個(gè)神經(jīng)元活動(dòng)，為解析復(fù)雜行為、前額葉皮層、海馬等深部腦區(qū)功能提供關(guān)鍵研究窗口。鈣離子（Ca2?）是核心信號(hào)分子，參與神經(jīng)元信號(hào)通訊、肌肉收縮、基因表達(dá)等大量細(xì)胞生理過(guò)程。細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化直接反映細(xì)胞激活狀態(tài)；科研人員通過(guò)持續(xù)監(jiān)測(cè)神經(jīng)元內(nèi)鈣離子波動(dòng)，就能解碼對(duì)應(yīng)特定行為的神經(jīng)活動(dòng)規(guī)律。

二、鈣成像的基本原理

鈣成像依靠專用熒光染料或基因編碼鈣指示劑來(lái)檢測(cè)鈣離子濃度變化，指示劑與鈣離子結(jié)合后會(huì)釋放熒光信號(hào)，常用的合成染料包括Fluo-4、Rhod-2、Oregon Green BAPTA，基因編碼指示劑則包括GCaMP和R-GECO等。

操作流程如下：

1. 導(dǎo)入指示劑

將選定的鈣指示劑導(dǎo)入目標(biāo)細(xì)胞。例如，對(duì)于神經(jīng)元，可通過(guò)注射、膜片微電極（patch pipette）導(dǎo)入，或使用病毒載體表達(dá)基因編碼指示劑。

2. 激發(fā)與檢測(cè)

指示劑進(jìn)入細(xì)胞后，用特定波長(zhǎng)的光（通常通過(guò)熒光顯微鏡）激發(fā)。當(dāng)指示劑與鈣離子結(jié)合后，其自身熒光特性會(huì)發(fā)生改變，該變化可通過(guò)高靈敏度相機(jī)或光電探測(cè)器捕捉記錄。

3. 圖像采集

顯微鏡隨時(shí)間連續(xù)拍攝細(xì)胞時(shí)序圖像，全程記錄熒光強(qiáng)度變化。指示劑熒光強(qiáng)度與細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度成正比 —— 鈣離子濃度升高，熒光增強(qiáng)；濃度降低，熒光減弱。

4. 數(shù)據(jù)分析

對(duì)采集到的熒光強(qiáng)度時(shí)序數(shù)據(jù)開展解析，提取細(xì)胞活動(dòng)核心信息。研究人員可量化鈣瞬變的頻率、幅度與持續(xù)時(shí)長(zhǎng)，這些指標(biāo)分別對(duì)應(yīng)不同細(xì)胞電生理事件，神經(jīng)元中的鈣瞬變通常直接關(guān)聯(lián)動(dòng)作電位。

5. 空間與時(shí)間模式觀測(cè)

鈣成像可同步觀測(cè)多個(gè)細(xì)胞，直觀展現(xiàn)鈣活動(dòng)在空間、時(shí)間維度的分布特征，幫助研究者理清神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)內(nèi)部細(xì)胞間的交互規(guī)律。

不過(guò)，鈣成像也存在一些局限，包括光毒性（強(qiáng)光損傷細(xì)胞）、光漂白（熒光信號(hào)隨時(shí)間衰減）以及指示劑可能干擾細(xì)胞正常功能。此外，指示劑對(duì)鈣離子的親和力及結(jié)合/解離速率也會(huì)影響測(cè)量準(zhǔn)確性。

三、鈣成像與嚙齒類動(dòng)物行為學(xué)研究

鈣成像實(shí)驗(yàn)會(huì)產(chǎn)生海量腦部信號(hào)數(shù)據(jù)，想要將神經(jīng)活動(dòng)與動(dòng)物行為精準(zhǔn)關(guān)聯(lián)，科研人員通常搭配專業(yè)行為分析軟件工具，例如諾達(dá)思公司推出的動(dòng)物運(yùn)動(dòng)軌跡跟蹤系統(tǒng)(EthoVision XT)。該軟件可在鈣成像同步記錄過(guò)程中，精準(zhǔn)追蹤、量化嚙齒動(dòng)物的全部行為表型。

鈣成像行為研究實(shí)例

1. 社交行為研究：一項(xiàng)發(fā)表于《Nature Communications》的研究利用鈣成像技術(shù)探究了小鼠體內(nèi)血清素能神經(jīng)元在社交行為中的調(diào)控作用。研究者整合鈣成像記錄與行為分析手段，觀察特定血清素能神經(jīng)元群體的活動(dòng)如何影響小鼠社交互動(dòng)行為。該研究揭示了血清素能神經(jīng)元在調(diào)節(jié)社交行為中的重要性，為社交互動(dòng)的神經(jīng)機(jī)制提供了新見解。

2. 威脅感知研究：另一項(xiàng)發(fā)表于《Cell Reports》的研究檢測(cè)了小鼠遭遇危險(xiǎn)刺激時(shí)杏仁核的神經(jīng)活動(dòng)。研究者發(fā)現(xiàn)丘腦旁細(xì)胞下旁束核、腦橋外側(cè)臂旁核兩大腦區(qū)，均存在表達(dá)降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）的神經(jīng)元。這類神經(jīng)元可接收多感官通道的危險(xiǎn)信號(hào)，并向杏仁核不同分區(qū)傳遞負(fù)性情緒信號(hào)。研究表明，兩類 CGRP 神經(jīng)元及其投射至杏仁核的神經(jīng)連接，是動(dòng)物感知多模態(tài)危險(xiǎn)刺激、形成厭惡記憶的核心結(jié)構(gòu)。該成果揭示了先天威脅感知統(tǒng)一神經(jīng)通路，有望為先天性恐懼相關(guān)精神疾病的治療提供新思路。

四、鈣成像結(jié)合行為研究的優(yōu)勢(shì)

1. 實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)捕捉：鈣成像能夠?qū)崟r(shí)記錄神經(jīng)元活動(dòng)動(dòng)態(tài)變化，直觀觀測(cè)特定行為如何激活不同神經(jīng)元集群，并完整追蹤神經(jīng)活動(dòng)時(shí)序變化。通過(guò)對(duì)比探索、社交、恐懼應(yīng)激等不同行為狀態(tài)下的神經(jīng)信號(hào)，能夠深入拆解復(fù)雜行為背后的底層神經(jīng)機(jī)制。

2. 深腦區(qū)研究：鈣成像技術(shù)可用于觀測(cè)前額葉皮層、海馬等調(diào)控核心行為的深部腦區(qū)，清晰闡明這類腦區(qū)神經(jīng)活動(dòng)如何調(diào)控動(dòng)物外在行為輸出。

3. 藥效評(píng)估應(yīng)用：鈣成像還能評(píng)估各類治療干預(yù)方案的實(shí)際效果。研究者可長(zhǎng)期持續(xù)監(jiān)測(cè)靶標(biāo)腦區(qū)的神經(jīng)活動(dòng)，判斷藥物給藥、腦深部電刺激等干預(yù)措施對(duì)神經(jīng)環(huán)路動(dòng)態(tài)、動(dòng)物行為帶來(lái)的影響。

五、鈣成像研究中的其他常用模式物種

除小鼠、大鼠外，多種模式生物同樣廣泛應(yīng)用于鈣成像行為學(xué)研究，各自適配獨(dú)特的行為研究方向：

斑馬魚

胚胎與幼魚通體透明，可實(shí)現(xiàn)非侵入式活體神經(jīng)活動(dòng)成像；體型小巧、發(fā)育速度快，十分適配高通量行為篩選實(shí)驗(yàn)。例如，斑馬魚幼魚鈣成像相關(guān)研究，已為個(gè)體化癲癇治療提供了潛在線索。

果蠅

神經(jīng)系統(tǒng)研究經(jīng)典模型，神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)清晰，行為多樣（求偶、運(yùn)動(dòng)、學(xué)習(xí)、記憶）。鈣成像有助于解析相關(guān)行為的神經(jīng)回路。可參考Patel等人（2022）的研究，他們結(jié)合鈣成像和EthoVision XT分析了動(dòng)物如何感知無(wú)害或潛在有害刺激。

秀麗隱桿線蟲

雖體型微小、神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，擁有獨(dú)特研究?jī)?yōu)勢(shì)；但線蟲固定操作難度高，為鈣成像實(shí)驗(yàn)帶來(lái)較大挑戰(zhàn)。目前已有研究開發(fā)出利用海藻酸鈉凝膠捕獲線蟲的全新固定方法，大幅優(yōu)化該物種實(shí)驗(yàn)條件。

斑胸草雀

鳴禽，以復(fù)雜的發(fā)聲學(xué)習(xí)行為著稱。一項(xiàng)研究通過(guò)鈣成像和雙光子顯微鏡，追蹤了從高級(jí)腦區(qū)到肌肉運(yùn)動(dòng)的發(fā)聲過(guò)程，發(fā)現(xiàn)前腦結(jié)構(gòu)HVC中的前運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元在歌唱的特定時(shí)間點(diǎn)被激活。

六、總結(jié)

總之，鈣成像結(jié)合單光子或雙光子成像技術(shù)，將在嚙齒動(dòng)物行為及其神經(jīng)相關(guān)性研究中持續(xù)發(fā)揮關(guān)鍵作用。該技術(shù)以高空間分辨率測(cè)量神經(jīng)元活動(dòng)的能力尤為突出，不僅能記錄單個(gè)神經(jīng)元的活動(dòng)，還能精確定位參與特定行為的神經(jīng)元和腦區(qū)。

這些發(fā)現(xiàn)有助于闡明行為的神經(jīng)基礎(chǔ)，并可能為未來(lái)治療應(yīng)用提供潛在靶點(diǎn)。隨著諾達(dá)思的動(dòng)物運(yùn)動(dòng)軌跡跟蹤系統(tǒng)(EthoVision XT)和鼠類家居行為活動(dòng)觀測(cè)箱(PhenoTyper)等工具的不斷進(jìn)步，它們可與鈣成像系統(tǒng)無(wú)縫集成，使研究者能夠在自由活動(dòng)的小鼠和大鼠中分析和解讀鈣成像數(shù)據(jù)，進(jìn)一步深化我們對(duì)行為的理解。

歡迎關(guān)注我們的公眾號(hào)，了解更多精彩內(nèi)容